DNAポリメラーゼは分子生物学の重要な酵素であり、DNA複製と修復プロセスにおいて中心的な役割を果たします。実験室では、DNAポリメラーゼの精製は、慎重な計画と実行を必要とする細心の多いマルチステッププロセスです。 DNAポリメラーゼサプライヤーとして、私はこの浄化プロセスの複雑さに精通しているので、詳細をあなたと共有したいと思います。
初期ステップ：細胞の成長と溶解
DNAポリメラーゼを精製する最初のステップは、酵素を発現する細胞の成長から始まります。一般的に、大腸菌などの細菌は宿主細胞として使用され、培養しやすく、急速に成長し、標的DNAポリメラーゼを過剰発現するように遺伝子組み換えできるためです。細菌は通常、温度、pH、および曝気の制御された条件下で適切な培地で成長します。たとえば、大腸菌は、Luria -Bertani（LB）スープのような豊富な媒体で37°Cでしばしば培養されます。
細胞が適切な密度に達すると、遠心分離によって収穫されます。次に、細胞ペレットをバッファ溶液に再懸濁します。細胞からDNAポリメラーゼを放出するために、溶解ステップが実行されます。機械的方法（超音波処理など）、化学的方法（Triton X -100などの洗剤を使用）、酵素法（リゾチームを使用して細菌細胞壁を分解する）など、細胞溶解にはいくつかの方法があります。超音波処理は、酵素に重大な損傷を引き起こすことなく、細胞を効果的に破壊する可能性があるため、一般的な選択です。ただし、DNAポリメラーゼを変性させる可能性のあるサンプルを加熱することを避けるために、慎重に制御する必要があります。
粗抽出物の準備と説明
細胞溶解後、得られた混合物には、タンパク質、核酸、脂質、細胞破片など、さまざまな細胞成分が含まれています。これは粗抽出物として知られています。大きなスケールの破片を除去するために、粗抽出物は高速で遠心分離されます。 DNAポリメラーゼを含む可溶性タンパク質を含む上清は慎重に収集されます。
粗抽出物には、その後の精製ステップを妨げる可能性のあるかなりの量の核酸が含まれる場合があります。これらの核酸を除去するために、ポリエチレンイミン（PEI）などの多型化合物を使用して降水ステップを実行できます。 PEIは負に帯電した核酸に結合し、それらを沈殿させ、遠心分離によって除去することができます。
クロマトグラフィー精製
クロマトグラフィーは、DNAポリメラーゼ精製の基礎です。使用できるクロマトグラフィー技術にはいくつかのタイプがあり、それぞれが分離の異なる原理に基づいています。
イオン - 交換クロマトグラフィー
イオン - 交換クロマトグラフィーは、多くの場合、精製プロセスの最初のクロマトグラフィーステップです。ネット電荷に基づいてタンパク質を分離します。 DNAポリメラーゼは、特定のpHで特徴的な電荷を持っているため、正の帯電（アニオン - 交換）または負に帯電した（陽イオン - 交換）樹脂のいずれかに結合できます。たとえば、DNAポリメラーゼが特定のpHで正味負電荷を持っている場合、アニオン - ジエチルアミノエチル（DEAE）セルロースなどの交換樹脂を使用できます。粗抽出物はカラムにロードされ、DNAポリメラーゼは樹脂に結合し、異なる電荷を持つ他のタンパク質が通過します。結合したDNAポリメラーゼは、緩衝液の塩濃度を増加させることにより溶出できます。この方法は、多くの汚染物質の除去に効果的であり、サンプル内のDNAポリメラーゼを大幅に濃縮できます。
アフィニティクロマトグラフィー
アフィニティクロマトグラフィーは非常に特異的な精製方法です。 DNAポリメラーゼと樹脂に固定されたリガンドとの間の特定の相互作用を利用します。一般的なアプローチの1つは、彼のタグシステムを使用することです。 DNAポリメラーゼがヒスチジンタグ（HIS -TAG）を含むように遺伝子組み換えされている場合、ニッケル - ニトリロトリア酢酸（Ni -NTA）樹脂を使用できます。 His -Tagは、樹脂のニッケルイオンに特異的に結合し、DNAポリメラーゼをカラムに選択的に保持できるようにします。彼のタグを持っていない他のタンパク質は、列を通過します。結合したDNAポリメラーゼは、ニッケルイオンに結合するためにHIS -TAGと競合するバッファーにイミダゾールを添加することにより溶出できます。
使用できる別のタイプのアフィニティクロマトグラフィーは、DNA-アフィニティクロマトグラフィーです。 DNAポリメラーゼはDNAに対して自然な親和性を持っているため、樹脂を含むDNAを使用できます。 DNAポリメラーゼは樹脂のDNAに結合し、他の非DNA結合タンパク質が除去されます。結合したDNAポリメラーゼは、塩濃度の増加や競合他社のDNAの追加など、バッファー条件を変更することで溶出できます。
サイズ - 除外クロマトグラフィー
サイズ - ゲルとしても知られる除外クロマトグラフィー - ろ過クロマトグラフィーは、そのサイズに基づいてタンパク質を分離します。コラムには多孔質ビーズが満たされています。小さなタンパク質は、ビーズの毛穴に入り、カラムを通るより長い経路を持つことができますが、大きなタンパク質はビーズの間のスペースを通過し、以前に溶出します。この方法は、残りの凝集体または小分子 - 重量汚染物質を除去するのに役立ちます。また、精製されたDNAポリメラーゼの分子量を決定するためにも使用できます。
最終的な浄化と品質管理
クロマトグラフィーステップの後、DNAポリメラーゼは通常高度に精製されます。ただし、まだいくつかの小さな汚染物質が存在する場合があります。疎水性相互作用クロマトグラフィーや逆位相クロマトグラフィーなどの最終的な研磨ステップを実行して、酵素をさらに精製することができます。
浄化が完了すると、厳密な品質管理措置が不可欠です。 DNAポリメラーゼの純度は、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS -Page）などの技術を使用して評価できます。ゲル上の単一のバンドは、高純度サンプルを示します。 DNAポリメラーゼの活性は、in vitro DNA合成アッセイを使用して測定できます。タンパク質の単位あたりの酵素活性の量である特定の活性は、精製されたDNAポリメラーゼの品質を評価するための重要なパラメーターです。
その他の関連酵素と当社の製品ポートフォリオ
DNAポリメラーゼに加えて、当社は、実験室研究のための他の高品質の酵素も提供しています。たとえば、GP41タンパク質2.0、DNA複製プロセスで重要な役割を果たしています。別の製品はですエキソヌクレアーゼIII 2.0、これはDNAの修復および修飾研究に役立ちます。そして私たちSC Reca 2.0相同組換えおよびDNA修復メカニズムに関与しています。
結論
実験室でのDNAポリメラーゼの浄化は、複雑だがやりがいのあるプロセスです。慎重な細胞の成長、溶解、クロマトグラフィー精製、および品質制御により、非常に純粋で活性なDNAポリメラーゼを得ることができます。 DNAポリメラーゼサプライヤーとして、私たちは科学コミュニティのニーズを満たすために最高の品質の製品を提供することに取り組んでいます。私たちのDNAポリメラーゼまたは他の酵素製品に興味がある場合は、調達とさらなる議論についてお問い合わせください。私たちは常に、あなたがあなたの研究プロジェクトに最適な試薬を確実に持っていることを保証するために、専門的なアドバイスとサポートを提供する準備ができています。
参照
- Sambrook、J。、およびRussell、DW（2001）。分子クローニング：実験室マニュアル。コールドスプリングハーバーラボラトリープレス。
- Scopes、RK（1994）。タンパク質精製：原則と実践。 Springer -Verlag。
- Deutscher、MP（1990）。タンパク質精製ガイド。アカデミックプレス。